Populārākas Posts

Redaktora Izvēle - 2019

PCR (polimerāzes ķēdes reakcija)

Ne tik sen tika izstrādāta uzticama, ļoti jutīga un ātra metode dažādu infekcijas slimību diagnosticēšanai. Šo metodi sauc par "PCR analīzi". Kas tas ir, kāda ir tās būtība, kādus mikroorganismus var atklāt un kā to izdarīt, mēs pastāstīsim savā rakstā.

Atklāšanas vēsture

Amerikāņu zinātnieks Carey Mullis 1983. gadā izgudroja polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) metodi, un Cetus Corporation diagnostikas metode, kurā tās radītājs strādāja, sākotnēji tika patentēts. Bet 1992. gadā visas tiesības un patenti tika pārdoti Hoffman-La Roche. Pēc tam izrādījās, ka paralēli līdzīgi pētījumi tika veikti, un tos reģistrēja citi amerikāņu biologi, piemēram, Alice Chan, David Edgar un John Trell. 1980. gadā šo problēmu risināja arī padomju zinātnieki A. Slyusarenko, A. Kaledins un S. Gorodetskis. Tāpēc nebija iespējams noteikt vienīgo tiesību īpašnieku. Daudzi izcili bioķīmiķi ir devuši noteiktu ieguldījumu PCR metodikas izstrādē un ir patentējuši savas inovācijas. Pašlaik PCR analīze tiek veikta visur speciāli aprīkotās laboratorijās.

Kāpēc PCR diagnostikai ir šāda vērtība?


Viena no PCR metodes priekšrocībām ir augsta jutība - no 95 līdz 100%. Tomēr šiem pabalstiem jābūt balstītiem uz šādu nosacījumu obligātu ievērošanu:

  1. pareizu savākšanu, bioloģiskā materiāla transportēšanu, t
  2. sterilu, vienreiz lietojamu instrumentu, īpašu laboratoriju un apmācītu personālu t
  3. stingra metožu un sterilitātes ievērošana analīzes laikā
Jutīgums ir atšķirīgs dažādiem konstatējamiem mikrobiem. Piemēram, PCR metodes jutība pret C hepatīta vīrusa noteikšanu ir 97-98%, jutīgums ureaplasmas noteikšanai ir 99-100%.

PCR analīzei raksturīgās iespējas ļauj sasniegt nepārspējamu analītisko specifiku. Tas nozīmē to mikroorganismu identifikāciju, kurus jūs meklējat, nevis līdzīgu vai cieši saistītu.
PCR metodes diagnostiskā jutība un specifika bieži vien ir labāka par kultūras metodi, ko sauc par „zelta standartu” infekcijas slimību noteikšanai. Ņemot vērā kultūras kultivēšanas ilgumu (no vairākām dienām līdz vairākām nedēļām), PCR metodes priekšrocība kļūst acīmredzama.

PCR infekciju diagnosticēšanā
PCR metodes priekšrocības (jutīgums un specifiskums) nosaka plašu lietojumu klāstu mūsdienu medicīnā.
PCR diagnostikas galvenie lietojumi:

  1. dažādu lokalizācijas akūtu un hronisku infekcijas slimību diagnostika
  2. uzraudzīt terapijas efektivitāti
  3. patogēna tipa specifikācija
PCR tiek izmantots dzemdniecībā, ginekoloģijā, neonatoloģijā, pediatrijā, uroloģijā, venereoloģijā, nefroloģijā, infekcijas slimību klīnikā, oftalmoloģijā, neiroloģijā, phtisiopulmonoloģijā uc

PCR diagnostika tiek izmantota kopā ar citām pētniecības metodēm (ELISA, PIF, REEF uc). To kombināciju un lietderību nosaka ārstējošais ārsts.

Infekciozie patogēni, kas atklāti ar PCR

Vīrusi:

  1. HIV-1 un HIV-2 retrovīrusi
  2. herpetiformu vīrusi
  3. herpes simplex 1. un 2. tipa vīruss
  4. citomegalovīruss
  5. Epšteina-Barra vīruss
  6. varicella - zoster vīruss
  7. herpes cilvēka vīrusi 6 un 7
  8. C, B un A hepatīts
  9. cilvēka papilomas vīrusu
  10. masaliņu vīruss
  11. adenovīrusi
  12. rinovīrusi
  13. parvovīrusi
  14. pikornovīrusi

Baktērijas:
  1. mikobaktērija
  2. hlamīdijas
  3. mikoplazma
  4. salmonellas
  5. legionella
  6. Clostridiums
  7. gaiša treponema
  8. dažādiem patogēniem E. coli tipiem
  9. Vibrio cholerae
  10. riketsija
  11. Staphylococcus aureus
  12. meningīta baktēriju izraisītājs
  13. Helicobacter pylori
  14. ureaplasma
  15. gonorejas izraisītājs
  16. difterijas stick
  17. hemofīls bacillus

Šajā sarakstā ir visbiežāk sastopamie infekcijas ierosinātāji, kas atklāti ar PCR. Faktiski šis saraksts ir daudz plašāks, pastāvīgi atjaunojams, jo tiek sintezētas jaunas “sēklas”. Jāatzīmē arī tas, ka identificēto patogēnu saraksts tiek noteikts, pamatojoties uz to, ka klātbūtnē ir "primeri" katras konkrētās laboratorijas arsenālā.

Kāda ir polimerāzes ķēdes reakcijas būtība?

PCR pētījums ir molekulārās bioloģijas sasniegums un liels sasniegums. Šī ir metode, kas, atklājot DNS vai RNR svešā ģenētiskā materiāla (genoma), spēj atpazīt individuālās īpašības, kas raksturīgas tikai vienam mikroorganisma veidam, nesajaucot to ar kādu citu. Kā darbojas PCR metode un kā tā spēj atjaunot infekcijas šūnas uzvedību dzīvā organismā?

PCR process

Tātad tika atrasts nukleīnskābes fragments, taču tas ir vienīgais un nepietiek, lai veiktu reakciju, tāpēc tas ir kodēts (kopēšana). Tomēr turpmākajam procesam ir vajadzīgs liels skaits šādu mikroplotu, kas var nodrošināt tā reproducēšanu, aizpildot jaunus DNS segmentus, kas ir identiski atrastajam fragmentam (replikācija). Reproducēšana ir dabiska un raksturīga nukleīnskābes pazīme, kas tiks atkārtota, izmantojot polimerāzes fermentu pat ārpus dzīvā organisma (testa mēģenē ar paraugu), veidojot daudzus klonus, tas ir, tas aiziet ķēdes reakcija. Visi jaunie un jaunie fragmenti tiks klonēti, bet tikai tie, kuros pētnieks ir ieinteresēts. Tieši tāpēc Ir svarīgi veikt „tīru” analīzi, bez jebkādiem piemaisījumiem, un veikt pārbaudi ļoti uzmanīgi.

Ņemot vērā uzskaitītās polimerāzes ķēdes reakcijas iespējas, jūs varat uzminēt, kāpēc tā tik viegli atšķir ureaplasmu no mikoplazmas vai katras no tām no hlamīdijas.

Tādējādi, pat ja cilvēka ķermeņa miljonu šūnu vidū nav zaudēts dzīvais vīruss, bet tikai daļa no tās DNS, tad PCR, ja nekas to neļauj, tas, iespējams, atrisinās uzdevumu un ziņos par „svešzemju” klātbūtni ar pozitīvu rezultātu. Tā ir PCR būtība un galvenā priekšrocība.

Stiprās un vājās puses

Laboratorijai, kas veic PCR diagnostiku, ir visaugstākās prasības attiecībā uz aprīkojumu, testēšanas sistēmām un medicīnas personāla kvalifikāciju. Tā ir augsto tehnoloģiju laboratorija ar ļoti jutīgu un ļoti specifisku reaģentu arsenālu, tāpēc tai nav nekādu īpašu trūkumu. Vai tas ir pozitīvs rezultāts, ja klīniskās izpausmes nav, un tādējādi klīnika pirms dilemmas: vai man jāsāk ārstēšana vai nē?

Ārsts, novērojot pacientu, sāk apšaubīt testa rezultātu ticamību, jo viņš neredz slimības pazīmes. Bet tomēr Ņemot vērā PCR sistēmas augsto jutību, jāatceras, ka tas atklāj patogēnu pat pirmsklīniskajā stadijāun pozitīvs rezultāts šajā gadījumā ir vairāk priekšrocību nekā trūkums. Pamatojoties uz to, ārstējošajam ārstam ir jālemj par terapijas piemērotību, ņemot vērā citus plusi un mīnusus.

Diagnostikas priekšrocības, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju, ir acīmredzamas:

  • Augsta specifikasasniedzot 100%, ņemot vērā to, ka paraugā ir daļiņas nukleīnskābēm, kas raksturīgas konkrētam organismam, bet ir svešas cilvēkam,
  • Augsta veiktspējajo PCR ir augsto tehnoloģiju automatizēta metode, kas nodrošina spēju veikt testēšanu materiāla uzņemšanas dienā un atbrīvoties no pacienta no nevajadzīgiem traucējumiem,
  • PCR, kas strādā ar vienu paraugu, spēj veikt vairākus pētījumus un par tiematklāt vairākus patogēnus, ja viņa būs šāds uzdevums. Piemēram, hlamīdijas infekcijas diagnostikā, kur PCR ir viena no galvenajām metodēm, kopā ar hlamīdijām ir iespējams noteikt neonēriju (gonokoku), kas ir gonorejas izraisītājs. Turklāt netiek negatīvi ietekmēts rezultātu ticamība, t
  • PCR testēšana jumsuzrāda bīstamus mikroorganismus inkubācijas periodāja viņiem nav bijis laika, lai nodarītu ievērojamu kaitējumu organismam, tas ir, agrīna diagnostika brīdina par gaidāmo patoloģiskā procesa attīstību, kas ļauj sagatavoties tai un pilnībā to bruņot.

Turklāt, lai izvairītos no pārpratumiem, kas dažkārt rodas diagnozes laikā, PCR aizsargā sevi ar to, ka tā rezultātus var fiksēt (foto, dators), lai vajadzības gadījumā tos izmantotu ekspertu vajadzībām.

Negatīva atbilde tiek uzskatīta par normālu PCR reakcijās.norādot uz svešu nukleīnskābju fragmentu trūkumu, pozitīva reakcija norāda uz infekcijas esamību organismā, digitālās vērtības norāda uz vīrusa stāvokli un tā koncentrāciju testēšanas laikā. Tomēr pilnīgu analīzes dekodēšanu veic ārsts, kuram ir veikts īpašs pētījums par PCR. Mēģinot interpretēt rezultātus savā ziņā, nav nekādas jēgas, jo ir iespējams, kā tas notiek, nepareizi saprast un sākt uztraukties iepriekš.

Ko PCR „baidās”, ko tā var darīt un kā sagatavoties tam?

Tāpat kā citos pētījumos, dažreiz testa rezultāti izrādās viltus pozitīvi vai nepatiesikur PCR nav izņēmums. Tas var notikt šādos gadījumos:

  1. Procesa pārkāpumi vienā reakcijas posmā,
  2. Materiālu savākšanas, uzglabāšanas vai transportēšanas noteikumu neievērošana, t
  3. Materiālā piemaisījumu klātbūtne.

Tas liek domāt, ka infekciju PCR diagnoze ir jāvēršas uzmanīgi, uzmanīgi un uzmanīgi, pretējā gadījumā materiāla paraugi var mainīt to strukturālo struktūru vai pat sabrukt.

PCR diagnostikas posmi. Nepareizi rezultāti var izraisīt pārkāpumus jebkurā pētījuma posmā.

Infekciju PCR diagnostika pieder pie "zelta standartu" kategorijas starp citām laboratorijas metodēm, tāpēc to var izmantot, lai meklētu daudzu slimību patogēnus, kuriem pirmajā acu uzmetienā nav nekādas kopīgas iezīmes:

  • Dažādu lokalizācijas tuberkuloze, pneimonija (ieskaitot netipisku, ko izraisa hlamīdijas), t
  • Bērnu infekcijas (masalu masaliņa, parotīts, masalas),
  • Difterija,
  • Salmoneloze,
  • Zoonozes infekcijas slimība - listerioze (slimību raksturo dažādi simptomi ar limfmezglu bojājumiem, centrālo nervu sistēmu, iekšējiem orgāniem),
  • Slimības, ko izraisa Epstein-Barr vīrusa iekļūšana (infekciozā mononukleoze uc), t
  • Vēža patoloģija, ko izraisa HPV infekcija (HPV un tā veidi), t
  • Borrelioze (Laima slimība, ērču encefalīts), t
  • Helicobacter pylori infekcija, ko izraisa cilvēka kuņģī dzīvojošā cilvēka Helicobacter pylori mikroba. Ir pierādīts, ka Helicobacter izraisa kuņģa vai divpadsmitpirkstu zarnas vēzi 12,
  • Kandidoze un gandrīz visas STS.

Seksuāli transmisīvo infekciju PCR diagnostika ir īpaši svarīga, jo šādi izraisītās slimības bieži ilgst ilgi bez klīniskām izpausmēm, bet tad tās kļūst aktīvākas grūtniecības laikā un tādējādi apdraud bērna veselību un pat dzīvību. TORCH infekcijas arī darbojas līdzīgi. Daži no tiem („uzlīmēšana”) vienlaicīgi attiecas uz STI, tāpēc pēdējie prasa detalizētāku apsvērumu. Lasītājs varēs iepazīties ar populārākajām metodēm turpmākajās rakstu sadaļās.

Kā pareizi sagatavoties, lai iegūtu ticamu rezultātu?

Uzreiz, mēs atzīmējam, ka sagatavošana PCR ir diezgan vienkārša, jo pacientam nav nepieciešami īpaši pūliņi. Jums vienkārši jāizpilda trīs vienkārši uzdevumi:

  1. 24 stundas pirms testa nav dzimumakta,
  2. Lai iegūtu asinis no vēnas, jums ir jāatrodas tukšā dūšā, starp citu, nav iespējams dzert,
  3. Pārsniedz urīnu nakts laikā (no rīta - sterilā burkā, iegādājoties pirms tam aptiekā).

PCR var darboties jebkurā bioloģiskā vidē

PCR metode nav „asinskārs”, tāpēc tā pieņem jebkādu bioloģisku barotni, kurā ir aizdomas par infekcijas izraisītāju. izvēle - tas, kas jums nepieciešams pētniecībai, paliek ārsta ziņā.

Tādējādi, meklējot patogēnu, papildus asins analīzei (lai gan tas arī atbilst un vairumā gadījumu tiek ņemts paralēli citam materiālam), varat izmantot:

  • Smērējums (urogenitālā trakta izlāde),
  • Izdarīt mutes gļotādas, konjunktīvas, deguna, dzimumorgānu (sievietes no dzemdes kakla un maksts, vīrieši - no urīnizvadkanāla),
  • Siekalas
  • Cum
  • Priekšdziedzera sula,
  • Placentālie audi un amnija šķidrums (amnija šķidrums), t
  • Urīna nogulsnes (pēc centrifugēšanas), piemēram, lai noteiktu dažas STI un Mycobacterium tuberculosis,
  • Sputums un pleiras šķidrums tam pašam mērķim
  • Eksudāti
  • Cerebrospinālais šķidrums, ja ir aizdomas par centrālās nervu sistēmas bojājumu, t
  • Biopsijas materiāls (biopsija), ņemts no aknām, divpadsmitpirkstu zarnas, kuņģa utt.

Es vēlos pievienot iepriekš minētajam, ka pietiek ar testējamiem materiāliem visos gadījumos, pat skrāpējumos un izdalījumos, jo PCR metodes testēšanai nav nepieciešami lieli apjomi, ir pietiekami daudz analīzes un daži mikrolitri, kurus parasti ņem Eppendorf tipa mikrotube un nosūta uz pētniecību.

HIV un polimerāzes ķēdes reakcija

Parasti, veicot anonīmu aptauju pozitīvu imunoblotēšanas rezultātu gadījumā, HIV infekcijas diagnoze tiek atkārtota. Ja diagnoze ir apstiprināta, pacientam tiek noteikti papildu pētījumi:

  1. Izmantojot imunoloģiskās reakcijas, noteikt limfocītu CD absolūtās vērtības4 (imūnkompetentās šūnas - T-palīgi vai palīgi), ko inficēšanās sāk, pirmkārt, pēc tam viņi zaudē savas pamatīpašības un nevar atšķirt "viņu" un kāda cita cilvēka īpašības. " Asins plazmā cirkulējošā vīrusa RNS tiek uzskatīta par normālām ķermeņa šūnām un nereaģē uz tām,
  2. Vīrusa RNS noteikšana ar PCR un vīrusu daļiņu koncentrācijas aprēķināšana, lai noteiktu stadiju, patoloģiskā procesa smagumu un prognozi, pamatojoties uz šiem datiem. Protams, vārds “norma” šajā ziņā nepastāv, jo reakcija vienmēr ir pozitīva, un skaitlisko vērtību atšifrēšana ir ārsta kompetencē.

PCR un hepatīts

C hepatīta patogēni var konstatēt, izmantojot PCR, visbiežāk testu izmanto, lai diagnosticētu C hepatītu, kas ir slikti konstatēts ar citām metodēm.

C hepatīta vīruss (RNS saturošs) tās uzvedībā cilvēka organismā ir līdzīgs HIV. Ievērojot aknu šūnu (hepatocītu) genomu, viņš paliek tur, gaidot savu stundu, kas var nākt pēc 2 gadiem, vismaz 20 gadiem, tāpēc ārsti viņu sauca par „maigu slepkavu”. C hepatīts izraisa ļaundabīga procesa veidošanos aknu parenhīmā, kas izpaužas vēlākos posmos. Imūnsistēma nenovēro visus šos notikumus, ņemot vīrusu hepatocītiem. Tiesa, antivielas pret vīrusu dažos daudzumos tiek ražotas, bet tās nesniedz pienācīgu imūnreakciju. ELISA diagnosticēšanai C hepatītam nav ļoti informatīvs raksturs, jo tas norāda, ka vīruss atstāj pēdas, un vai viņš pats nav palicis zināms. HCV gadījumā ir zināmi pašārstēšanās gadījumi, bet antivielas pret vīrusu paliek un turpina cirkulēt dzīvē (imunoloģiskā atmiņa). PCR ievērojami pārsniedz antivielu veidošanos un pēc 1-1,5 nedēļām var noteikt vīrusu daļiņu, bet antivielas var parādīties robežās no 2 mēnešiem līdz sešiem mēnešiem.

PCR diagnostika, ja ir aizdomas par C hepatīta vīrusa saslimšanu cilvēka organismā, ir visoptimālākā pētījuma metode, jo tikai tā spēj atpazīt „maigā ienaidnieka” klātbūtni pacienta asinīs vai aknu biopsijā.

Tomēr dažreiz ir gadījumi, kad AT ir pozitīvi, un PCR rezultāts ir negatīvs. Tas dažreiz notiek ar ļoti mazu vīrusa daudzumu vai tad, kad tas ir “neaktivizēts” aknās, neiedziļinoties asinīs. Lai atrastu patiesību, pacients tiek pārvērtēts vai pat vairāk nekā viens.

Cilvēka papilomas vīrusa infekcija

HPV (cilvēka papilomas vīruss), ja neārstējas, var arī bez ilgstošas ​​izpausmes palikt saimnieka ķermenī, un par to nav pat aizdomas, jo PCR nav paveikts un simptomi nebija. Tomēr cilvēka papilomas vīrusa infekcijas klātbūtne, lai gan latentā, ir tālu no vienaldzīgas pret cilvēka veselību, jo dažu veidu vīrusi, kas izraisa vēzi, ir īpaši bīstami (16. un 18. veids).

Biežāk sievietes puse no HPV cieš no HPV, jo vīruss vairāk mīl sieviešu dzimumorgānus, un jo īpaši dzemdes kaklu, kur dažu veidu vīrusi veicina displastisku procesu attīstību, un pēc tam dzemdes kakla vēzi, ja jūs neārstē displāziju un dodat brīvu vīrusu. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

TORCH infekcijas un STI ir tik savstarpēji saistītas, ka dažkārt ir grūti noteikt, kurai grupai ir jāpiešķir konkrēts patogēns. Tās parasti ir grūti saprotamas, jo tās ir diezgan dažādas mikroorganismu grupas, kuras vienmēr var būt seksuāli transmisīvas vai tikai noteiktos apstākļos (imūndeficīts), un tās var būt interesantas tikai grūtniecības laikā, ņemot vērā iespējamo negatīvo ietekmi uz tās gaitu un augli.

PCR - galvenā metode slēptās infekcijas noteikšanai

Klīnisko izpausmju attīstība balstās uz dažādiem patogēniem, kurus var atrast tikai ar PCR, kas ir tās galvenais uzdevums, dažkārt kopā ar ELISA un dažreiz kā vienīgais apstiprinošais tests, īpaši, ja slimības simptomi nav. Šāda sarežģīta situācija var radīt polimikrobiālu infekciju, kas papildus atklātajiem cēloņiem rada arī oportūnistiskus patogēnus.

Vīriešiem, kas cieš no dzimumorgānu sfēras iekaisuma slimībām, piemēram, uretrīts, hlamīdija, ureaplasma un mikoplazma bieži tiek atklāti. Šie paši veidi ir bīstami un sievietes ķermenis. Tie, kas zina chlamydia smaržu un ir saskārušies, noteikti atcerēsies, cik grūti ir to atrast un atpazīt, tāpēc PCR veiktā analīze par hlamīdijām ir īpaši uzticama, jo parazīts, kas slēpjas ļoti mazu izmēru šūnā, uzvedas piesardzīgi un vienmēr kaitē slepeni.

Ureaplasma bieži tiek uzskatīta par savienotu ar mikoplazmu. Un tas nav nejaušība. Šīs sugas, piemēram, hlamīdijas, nav ne vīrusi, ne baktērijas, tās dzīvo iekšējās šūnās un pieder STI, lai gan to klātbūtne veselīgā organismā ir tālu no retākiem. Tātad, lai atšķirt veselīgu pārvadātāju no slima cilvēka, ir nepieciešamas īpašas metodes, ja PCR tiek uzskatīts par visdrošāko, jo, ņemot vērā šo mikroorganismu struktūru un uzvedību, citi pētījumi ir neefektīvi.

Attiecībā uz herpes vīrusu (1., 2. tipa) un citomegalovīrusu, kas pieder arī herpes vīrusiem (5. tips), situācija ir arī neskaidra. Pasaules iedzīvotāju inficēšanās tuvojas 100%, tāpēc šajā gadījumā ir ļoti svarīgi identificēt vīrusu un tā devu, kas īpaši spēlē grūtniecības laikā, jo pieaugušais, kurš savā ķermenī iesakņojies, nerada nekādas problēmas un nedod slimības pazīmes.

Līdz ar to nevajadzētu ignorēt līdzīgu ārsta izrakstītu pārbaudi, jo dažos gadījumos polimerāzes ķēdes reakcija ir obligāta un nepieciešama laboratorijas diagnostikas metode, kas var aizsargāt ne tikai sievieti, bet arī mazu, nedzimušu personu no nopietnām komplikācijām.

Nobeigumā es vēlos atzīmēt, ka šāda brīnišķīga metode, piemēram, PCR, kalpo cilvēcei vairāk nekā 30 gadus. Tajā pašā laikā pārbaudes uzdevumi neaprobežojas tikai ar infekcijas slimību patogēnu meklēšanu. Polimerāzes ķēdes reakcija, kas dzimusi uz molekulārās bioloģijas pamata, ir nesaraujami saistīta ar ģenētiku veiksmīgi izmantota kriminālistikā personas identifikācijai- tiesu medicīnā paternitātes noteikšanai veterinārmedicīnā, ja dzīvnieku klīnikai ir iespēja iegādāties dārgu aprīkojumu, kā arī citās jomās (rūpniecība, lauksaimniecība utt.).

PCR diagnostikas metodes būtība

PCR analīze: kas tas ir un kā tas darbojas? Metodes būtība ir speciāla DNS polimerāzes enzīma izmantošana in vitro, lai palielinātu noteiktu mikrobu vidi. Lai to izdarītu, reiziniet pieejamo DNS materiālu. Tādējādi, patogēnā mikroorganisma klātbūtnē paraugā, tā daudzums palielināsies, pateicoties bioķīmiskām laboratorijas manipulācijām, un baktēriju mikroskopā nebūs grūti noteikt.

Kā ir pētniecības materiāls?

Nepieciešamajai analīzei:

  • DNS matrica
  • primeri, kas savieno materiāla gabalu galus
  • karstumizturīgs DNS polimerāzes enzīms, t
  • ķimikālijas, kas padara fermentus pareizu,
  • buferšķīdums, kas nepieciešams, lai radītu piemērotus apstākļus DNS materiāla augšanai un attīstībai.

Lai veiktu PCR, jāveic 25-30 atkārtojumi, kas sastāv no trim posmiem: denaturācija, atkausēšana un pagarināšanās.

Polimēras ķēdes reakcijas analīzei, izmantojot īpašu ierīci - pastiprinātāju. Modernā iekārta ļauj uzstādīt nepieciešamo apkures un dzesēšanas caurules programmu, lai novērstu kļūdas diagnostikā.

Kur tiek piemērota diagnoze?

Polimēras ķēdes reakcijas metodi izmanto dažādās medicīnas jomās:

  • kriminologi to izmanto, lai identificētu ģenētisko materiālu, piemēram, matus, siekalu vai asinis,
  • PCR asins analīze palīdz veikt genotipu noteikšanu, piemēram, lai noteiktu atsevišķu ģenētiski iekļautu reakciju uz konkrētu narkotiku,
  • izmantojot šo metodi, noskaidrojiet, vai pastāv radniecība starp cilvēkiem
  • Populārākā PCR metode ir kļuvusi medicīniskā diagnostikā dažādu infekcijas slimību noteikšanai.

Kādas infekcijas atklāj PCR?

Tātad, medicīna jau sen ir veiksmīgi izmantojusi PCR analīzi. Kas tas ir, mēs jau esam iemācījušies. Un kādi patogēni var tikt atklāti ar to? PCR diagnosticē šādas infekcijas slimības:

  • A, B, C hepatīts,
  • ureaplasmosis,
  • kandidoze
  • hlamīdijas
  • mikoplazmoze
  • Gardnereloze
  • infekcioza mononukleoze,
  • trichomonoze
  • cilvēka papilomas vīrusa infekcija
  • tuberkuloze,
  • 1. un 2. tipa herpes infekcija, t
  • helikobakterioze,
  • citomegalovīruss,
  • difterija,
  • salmonellas,
  • HIV infekcija.

Arī vēža diagnosticēšanai izmanto PCR metodes.

Metodes priekšrocības

PCR diagnostikai ir vairākas priekšrocības:

  1. Augsta jutība. Pat ar tikai dažām mikroorganismu DNS molekulām, PCR analīze nosaka infekcijas klātbūtni. Tas palīdzēs metode hroniskām un latentām slimībām. Bieži vien šādos gadījumos mikroorganisms nav kultivēts ar citiem līdzekļiem.
  2. Jebkurš materiāls ir piemērots pētniecībai, piemēram, siekalām, asinīm, dzimumorgānu izdalījumiem, matiem, epitēlija šūnām. Visbiežāk sastopams ir asins analīzes un urogenitālās uztriepes uz PCR.

Ieteikumi analīzei

Lai rezultāti būtu ticami, veicot PCR pētījumu, ir nepieciešams veikt analīzi, ievērojot ieteikumus par iepriekšēju sagatavošanu diagnostikai:

  1. Pirms siekalu nogādāšanas 4 stundas pirms materiālu savākšanas jāatturas no ēdiena un medikamentu lietošanas. Tūlīt pirms procedūras izskalojiet muti ar vārītu ūdeni.
  2. Iepriekš minētie noteikumi jāievēro, ja ņemiet paraugu no vaiga iekšpuses. Pēc skalošanas ieteicams veikt vieglu ādas masāžu, lai izceltu dziedzeru noslēpumu.
  3. Urīns parasti tiek savākts mājās. Lai to izdarītu, jums ir jāuztur rūpīga ģenitāliju tualete. Sterilā plastmasas traukā jāsavāc 50-60 ml urīna. Lai nodrošinātu materiāla tīrību, sievietēm ieteicams ievietot tamponu maksts, un vīriešiem, cik vien iespējams, velciet ādu. Jūs nevarat nodot materiālu menstruāciju laikā.
  4. Lai ziedot spermu, jums ir jāatturas no dzimumakta 3 dienas pirms materiāla uzņemšanas. Arī ārsti iesaka ne doties uz saunu un uzņemt karstu vannu, dzert alkoholu un pikantus ēdienus. 3 stundas pirms analīzes jums jāatturas no urinēšanas.
  5. Urogenitālās uztriepes ievadīšanai, piemēram, ja tiek analizēta PCR hlamīdija, gan sievietēm, gan vīriešiem ir ieteicams seksuāli atpūsties 3 dienas. 2 nedēļas pirms analīzes nevar lietot antibakteriālas zāles. Nedēļu jums jāpārtrauc intīma želeja, ziedes, maksts svecītes, douching lietošana. 3 stundas pirms testa jums jāatturas no urinēšanas. Menstruāciju laikā materiāls netiek savākts, tikai 3 dienas pēc asins izplūdes pārtraukšanas var veikt urogenitālo uztriepi.

PCR grūtniecības laikā

Gaidot bērnu, daudzas seksuāli transmisīvas infekcijas ir ārkārtīgi bīstamas augļa normālai attīstībai. STS var izraisīt intrauterīnu augšanas palēnināšanos, aborts vai priekšlaicīgu dzemdību un iedzimtas bērna anomālijas. Tādēļ ir ārkārtīgi svarīgi veikt PCR izmeklēšanu grūtniecības sākumā. Lai veiktu analīzi, ir nepieciešama reģistrācija - līdz 12 nedēļām.

Materiāls tiek ņemts no kakla kanāla, izmantojot īpašu suku. Procedūra ir nesāpīga un nerada apdraudējumu bērnam. Parasti grūtniecības laikā hlamīdijas tiek analizētas, izmantojot PCR metodi, kā arī ureaplasmozi, mikoplazmozi, citomegalovīrusu, herpes, papilomas vīrusu. Šāds komplekss pētījums, ko sauc par PCR-6.

PCR HIV diagnostikai

Sakarā ar to, ka polimerāzes ķēdes reakcija ir ļoti jutīga pret izmaiņām organismā un diagnozes apstākļiem, daudzi faktori var ietekmēt rezultātu. Tāpēc HIV infekcijas PCR analīze nav uzticama metode, tās efektivitāte ir 96–98%. Atlikušajos 2-4% gadījumu tests sniedz viltus pozitīvus rezultātus.

Taču dažās situācijās nav iespējams veikt bez HIV PCR diagnostikas. Parasti tas tiek veikts cilvēkiem ar ELISA kļūdaini negatīvu rezultātu. Šādi rādītāji liek domāt, ka cilvēkam vēl nav izveidojušās antivielas pret vīrusu, un nav iespējams tos noteikt bez vairākkārtēja skaitļa palielinājuma. To var panākt, veicot asins analīzi, izmantojot PCR metodi.

Šāda diagnoze ir nepieciešama arī bērniem, kas dzīvo pirmajā dzīves gadā un ir dzimuši HIV pozitīvai mātei. Šī metode ir vienīgais veids, kā droši noteikt bērna statusu.

PCR hepatīta diagnozei

Polimerāzes ķēdes reakcijas metode ļauj noteikt A, B, C hepatīta vīrusa DNS ilgu laiku pirms antivielu veidošanās pret infekciju vai slimības simptomu rašanos. C hepatīta PCR analīze ir īpaši efektīva, jo 85% gadījumu šāda slimība ir asimptomātiska un nonāk hroniskā stadijā bez savlaicīgas ārstēšanas.

Patogēna agrīna atklāšana palīdzēs izvairīties no komplikācijām un ilgstošas ​​ārstēšanas.

Visaptveroša PCR pārbaude

Visaptveroša PCR analīze: kas tas ir? Tā ir polimerāzes ķēdes reakcija, kas ietver vairāku veidu infekciju identificēšanu vienlaicīgi: mikoplazmas genitalium, mikoplazma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovīruss, ureaplasma urealytikum, 1. un 2. tipa herpes simplex, gonoreja, sifiliss, papilomavīruss, papilomavīruss, papilomavīts, 1. un 2. tipa herpesīts, gonoreja, 1. un 2. tipa herpesīts, gonoreja, gonoreja, pimplasma. Šādas diagnostikas cena svārstās no 2000 līdz 3500 rubļiem. atkarībā no klīnikas, izmantotajiem materiāliem un iekārtām, kā arī analīzes veida: kvalitatīvs vai kvantitatīvs. Kas nepieciešams jūsu gadījumā - ārsts izlems. Dažos gadījumos ir pietiekami tikai noteikt patogēna klātbūtni, citos, piemēram, HIV infekcijas gadījumā, svarīga loma ir kvantitatīvajam titram. Diagnosticējot visus iepriekš minētos patogēnus, aptauju sauc par "PCR-12 analīzi".

Analīzes rezultātu atšifrēšana

PCR analīzes dekodēšana ir vienkārša. Ir tikai divi rādītāji - “pozitīvs rezultāts” un “negatīvs rezultāts”. Ja tiek atklāts patogēns, ārsti var ar 99% ticamību apstiprināt slimības klātbūtni un turpināt ārstēt pacientu. Kvantitatīvajā infekcijas noteikšanas metodē attiecīgajā kolonnā tiks norādīts skaitliskais indikators, kas liecina par atklātajām baktērijām. Tikai ārsts var noteikt slimības apjomu un noteikt nepieciešamo ārstēšanu.

Dažos gadījumos, piemēram, nosakot HIV infekciju ar PCR, ar negatīvu rezultātu, ir nepieciešams veikt papildu pārbaudes, lai apstiprinātu iegūtos rādītājus.

Kur veikt analīzi?

Kur nokārtot PCR analīzi: publiskajā klīnikā vai privātā laboratorijā? Diemžēl pašvaldību medicīnas iestādēs aprīkojums un metodes bieži ir novecojušas. Tāpēc labāk ir dot priekšroku privātajām laboratorijām ar modernu aprīkojumu un augsti kvalificētu personālu. Turklāt privātā klīnikā jūs iegūsiet rezultātus daudz ātrāk.

Maskavā daudzas privātās laboratorijas piedāvā PCR analīzi dažādām infekcijām. Piemēram, tādās klīnikās kā Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro analizē PCR. Apsekojuma cena ir no 200 rubļiem. viena patogēna noteikšanai.

Var secināt, ka infekcijas slimību diagnosticēšana, izmantojot PCR, vairumā gadījumu ir ātrs un uzticams veids, kā konstatēt patogēnu organismā agrīnā infekcijas stadijā. Tomēr dažos gadījumos ir vērts izvēlēties citas diagnostikas metodes. Tikai speciālists var noteikt šāda pētījuma nepieciešamību. PCR analīzes dekodēšanai nepieciešama arī profesionāla pieeja. Ievērojiet ārsta ieteikumus un nelietojiet savus testus, kas nav nepieciešami.

PCR diagnostikas priekšrocības mūsdienu medicīnā:

• pētāmā parauga tieša atklāšana patogēnas klātbūtnei (proti, specifiskam patogēna DNS vai RNS apgabalam).
• Augsta specifika ļauj noteikt unikālu DNS vai RNS reģionu, kas ir raksturīgs konkrētam patogēnam, kas novērš viltus reakciju iespēju.
• PCR metodes augsta jutība ļauj atklāt pat atsevišķas patogēnu šūnas (vīrusi, baktērijas). PCR analīzes jutīgums ir 10-1000 šūnas pētāmajā paraugā (piemēram, imunoloģisko un mikroskopisko testu jutība ir tikai 103-105 šūnas).
• Universāla PCR metodes izstrāde dažādu patogēnu noteikšanai. Pētījuma objekts ar PCR ir patogēna ģenētiskais materiāls (DNS, RNS). Šī metode ļauj identificēt vairākus patogēnus no viena bioloģiskā parauga.
• pietiekami ātri, lai iegūtu analīzes rezultātu. Pilna izpēte tiek veikta 4-4,5 stundas, retāk - nedaudz ilgāk.
• Iespēja atklāt patogēnus pirms simptomu rašanās (preklīniskā diagnoze) un pēc pēdējās slimības (retrospektīva diagnoze). Preklīniskās diagnostikas piemērs tiks pārbaudīts inkubācijas periodā (no infekcijas brīža līdz pacienta sūdzībām), kā arī latentā infekcija (ja vispār nav simptomu, bet tikai laboratorijas dati - piemēram, PCR). Viens no svarīgākajiem PCR diagnostikas punktiem ir PCR arhīva materiālos vai bioloģiskajos atliekos, kas ir svarīga personas vai tēva identifikācijai.

Pašlaik PCR diagnostikā notiek ievērojama attīstība. Pati metode tiek uzlabota, jauna veida PCR parādās atkal un atkal, jaunas reakcijas sistēmas šai reakcijai nonāk medicīnas tirgū. Tāpēc PCR pētījumu izmaksas katru gadu kļūst pieejamas plašākam pacientu lokam.

Kāda ir uz PCR balstīta metode?

Polimerāzes ķēdes reakcijas pamatā ir atkārtota divkāršošanās (amplifikācija) noteiktai DNS vai RNS daļai ar fermentu palīdzību laboratorijā. Rezultātā tiek iegūts pietiekams DNS vai RNS daudzums vizuālai analīzei. Pētījuma gaitā tiek kopēta tikai teritorija, kas atbilst norādītajiem nosacījumiem, un tikai situācijā, kad tā atrodas pētāmajā paraugā.

Piemēram, pētījuma materiāls, kurā pieņemts, ka ir DNS fragmenti vai patogēna RNS (siekalas, asinis, urīns, izdalīšanās no dzimumorgāniem), tiek ievietots īpašā reaktorā (pastiprinātājā). Pēc tam pievieno specifiskus enzīmus, kas saistās ar patogēna DNS vai RNS, un tā kopija tiek sintezēta. Šī kopēšana notiek vairākos „ķēdes reakcijas” posmos, un galu galā simtiem un tūkstošiem kopiju var veidot no viena ģenētiskā materiāla kopijas. Tad tiek analizēts un salīdzināts rezultāts ar esošo datubāzi par dažādu patogēnu struktūru. Izmantojot PCR, ir iespējams ne tikai noteikt patogēna veidu, bet arī iegūt kvantitatīvu analīzes rezultātu, tas ir, cik patogēnu ir cilvēka organismā.

PCR metode patlaban paplašina pētniecības iespēju klāstu: ievieš mutācijas, savieno DNS fragmentus un plaši izmanto medicīnā, piemēram, lai noteiktu paternitāti, jaunu gēnu parādīšanos utt.

Kādas infekcijas var noteikt, izmantojot PCR diagnozi

1) HIV infekcija (var atklāt cilvēka imūndeficīta vīrusu HIV-1)
2) Vīrusu hepatīts A, B, C, G (RNS-HAV, DNS-HBV, RNS-HCV, RNS-HGV)
3) Infekcioza mononukleoze (Epstein-Barr vīrusa-VEB DNS)
4) citomegalovīrusa infekcija (DNS-CMV)
5) Herpes infekcija (herpes simplex DNS - HSV 1. un 2. tips)
6) STI (seksuāli transmisīvās infekcijas) - ureaplasmosis, gardnereloze, hlamīdijas, mikoplazmoze, trichomonoze,
7) Tuberkuloze (Mycobacterium tuberculosis)
8) Onkogēni vīrusi - cilvēka papilomas vīrusa infekcija (cilvēka papilomas vīruss (ieskaitot tās onkogēnās sugas 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 un 59)
9) Borrelioze, ērču encefalīts
10) Listerioze
11) Candida (Candida ģints sēnes)
12) Helicobacter pylori infekcija (Helicobacter pylori)
un citi

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

Seksuāli transmisīvo infekciju (STI) pārbaude vīriešiem un sievietēm ietver dzimumorgānu sekrēciju, uztriepes vai skrāpējumu no dzemdes kakla, uztriepes vai skrāpējumu no urīnizvadkanāla (urīnizvadkanāla), urīnu.

Pārbaudot infekcijas (herpes infekcijas, CMVI, mononukleozi, toksoplazmozi, hepatītu B, C, HIV infekciju), tiek ņemta asinis uz PCR.

Infekciozas mononukleozes, CMV, herpes infekcijas, rīkles tampona diagnosticēšanai un CMV urīna testēšanai. Bieži nervu sistēmas bojājumu izmeklēšanai vairāki pētījumi savāc mugurkaula šķidrumu.

Pulmonoloģijā materiāls ir krēpas, pleiras šķidrums.

Pārbaudot intrauterīnās infekcijas - amnija šķidrumu, placentas audus.

Sagatavošanās materiāla piegādei un PCR diagnostikai

Gandrīz visiem pacientiem, kam veikta PCR diagnostika, ir tiesības paļauties uz ticamiem, precīziem un ātriem rezultātiem, kas lielā mērā ir atkarīgi no laboratorijas jaudas un laboratorijas tehniķa profesionalitātes. Tajā pašā laikā daudzi cilvēki neuzskata, ka šī uzticamība daudzos aspektos ir atkarīga no sevis, proti, uz ārstējošā ārsta ieteikumiem, dzīves veidu un materiālu paraugu ņemšanas pareizību. Veicot materiālu, ir vajadzīgi nosacījumi, kas izslēdz materiāla piesārņojumu (piesārņojumu) un attiecīgi apšauba analīzes objektivitāti.

Pareiza sagatavošana materiāla piegādei nav īpaši sarežģīta. Pastāv šādi ārsta ieteikumi pacientiem:

1) dienu pirms materiāla piegādes neizmanto seksuālo dzīvi, t
2) asinis, kas paredzētas pētījumiem, lai atteiktos no rīta tukšā dūšā (neēd, nedzer);
3) pēc urīna ievadīšanas pirmā rīta daļa tiek savākta tīrā sterilā traukā.

PCR rezultātu skaidrojums

Negatīvs PCR rezultāts norāda, ka pētījumā esošajā materiālā piegādes laikā nav konstatētas infekcijas izraisītāju pēdas. Vairums gadījumu liecina par infekcijas trūkumu, ko viņi mēģināja atrast testā.

Pozitīvs PCR rezultāts norāda uz infekcijas pēdu noteikšanu pētītajā bioloģiskajā paraugā. Ar lielu precizitāti pozitīvs rezultāts norāda uz infekcijas esamību noteiktā brīdī.

Pastāv situācijas, kad PCR ir pozitīva, un nav iespējams runāt par aktīvo infekciju - tā ir tā sauktā „veselīgā nesējstacija” bez slimības klīniskiem simptomiem, kam nav nepieciešama ārstēšana, bet nepieciešama dinamiska novērošana no ārsta. Biežāk novēro virkni vīrusu infekciju (HPV, CMVI, EBV infekcija, herpes infekcija uc) tādos materiālos kā siekalas, kakla kanāla skrāpēšana, urīnizvadkanāls, tas ir, no lokālā fokusa. Tomēr mēs nedrīkstam aizmirst, ka pārraidīšana no pārvadātājiem uz veseliem cilvēkiem ir iespējama, kā arī pāreja uz slimības hronisko formu ar aktivizācijas procesu. Ja PCR ir pozitīvs asinīs, tad tas vairs nav nesēja stāvoklis un tam nepieciešama īpaša ārstēšana.

PCR kvantitatīvo rezultātu novērtē tikai ārsts individuāli infekcijai atsevišķi un tam nav kopēju gradāciju. Pamatojoties uz PCR kvantitatīvo rezultātu, ārsts var noteikt infekcijas aktivitātes pakāpi un noteikt slimības stadiju, kas noteikti ietekmēs paredzēto zāļu devu un devu.

Viens no pēdējiem aizraujošajiem jautājumiem: cik precīza ir PCR diagnostika?

PCR analīzei ir trīs definīcijas:

1. Precizitāte (ar lielu varbūtību, ka iespējama infekcijas atklāšana vai neesamība).
2. Specifiskums (konkrētas infekcijas noteikšanas precizitāte).
3. Jutīgums (pat ar nelielu patogēno ģenētiskā materiāla saturu pētāmajā paraugā, infekcija tiks atklāta).

Polimerāzes ķēdes reakcija rada gandrīz nekādus viltus pozitīvus rezultātus (tas nozīmē, ka nav pozitīvu paraugu, ja nav infekcijas). Viltus negatīvus rezultātus reti novēro (biežāk tas ir saistīts ar aktīvas infekcijas neesamību cilvēkam šobrīd). Piemēram, latentā infekcija, hroniska infekcija ārpus aktivitātes.

Saturs

Septiņdesmito gadu sākumā Norvēģijas zinātnieks Kjell Kleppe no Nobela prēmijas laureāta laboratorijas Khara Gobinda Quran ierosināja metodi, lai pastiprinātu DNS, izmantojot pāris īsas viencilvēciskas DNS molekulas - sintētiskos primerus [1]. Tomēr tajā laikā šī ideja palika neizpildīta. Polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) 1983. gadā izgudroja amerikāņu bioķīmiķis Carey Mullis [2] [3]. Viņa mērķis bija izveidot metodi, kas ļautu DNS amplifikāciju vairāku secīgu sākotnējo DNS molekulu divkāršošanas laikā, izmantojot enzīmu DNS polimerāzi. Pirmā publikācija par PCR metodi parādījās 1985. gada novembrī žurnālā Science [4]. Metode revolucionizēja molekulāro bioloģiju un medicīnu. 1993. gadā Carey Mullis saņēma Nobela prēmiju ķīmijā par to. [5].

Metodes izmantošanas sākumā pēc katras apkures dzesēšanas cikla reakcijas maisījumam bija jāpievieno DNS polimerāze, jo tā tika inaktivēta augstā temperatūrā, kas nepieciešama DNS spirāles ķēžu atdalīšanai. Reakcijas procedūra bija salīdzinoši neefektīva, pieprasot daudz laika un fermentu. 1986.gadā ievērojami uzlabojās polimerāzes ķēdes reakcijas metode. Tika ierosināts izmantot DNS polimerāzes no termofilām baktērijām [6]. Šie fermenti bija termostabili un spēja izturēt daudzus reakcijas ciklus. To izmantošana ir ļāvusi vienkāršot un automatizēt PCR. Viena no pirmajām termostabilajām DNS polimerāzēm tika izolēta no baktērijām Thermus aquaticus un nosaukts Taq-polimēru. Šīs polimerāzes trūkums ir diezgan liela varbūtība ieviest kļūdainu nukleotīdu, jo šim fermentam nav mehānismu kļūdu labošanai (3 '→ 5'-eksonuklāzes aktivitāte). Polimerāze Pfu un Pwo, kas izolēti no arhīviem, ir šim mehānismam, to lietošana ievērojami samazina mutāciju skaitu DNS, bet to ātrums (procesivitāte) ir zemāks nekā Taq. Tagad uzklājiet maisījumu Taq un Pfuvienlaicīgi sasniegt augstu sacietēšanas ātrumu un augstu kopiju precizitāti.

Metodes izgudrošanas laikā Carey Mullis strādāja par sintētisku ķīmiķi (viņš sintezēja oligonukleotīdus, kurus pēc tam izmantoja, lai identificētu punktu mutācijas ar hibridizāciju ar genomu DNS) Cetus (Cetus Corporation), kas patentēja PCR metodi. 1992. gadā Cetus pārdeva tiesības izmantot šo metodi un patentu Taq-polimēra uzņēmums Hofman-La Roche par 300 miljoniem ASV dolāru. Tomēr izrādījās, ka Taq-polimēru raksturoja padomju bioķīmiķi A. Kaledins, A. Slusarenko un S. Gorodetskis 1980. gadā [7], un 4 gadus pirms šīs padomju publikācijas, tas ir, 1976. gadā, amerikāņu biochemisti Alice Čien, David B. Edgar un John M. Trela. [8] Šajā sakarā uzņēmums Promega tiesā nolēma piespiest Rosh atteikties no ekskluzīvajām tiesībām uz šo fermentu [9]. ASV patents attiecībā uz PCR beidzās 2005. gada martā.

Metode balstās uz atkārtotu selektīvu DNS nukleīnskābes daļas kopēšanu ar fermentu palīdzību mākslīgos apstākļos (in vitro). Ja tas notiek, tiek kopēts tikai apgabals, kas atbilst norādītajiem nosacījumiem, un tikai tad, ja tas atrodas pētāmajā paraugā. Atšķirībā no DNS amplifikācijas dzīvajos organismos (replikācija), salīdzinoši īsas DNS daļas tiek pastiprinātas ar PCR. Parastajā PCR procesā kopējamo DNS sekciju garums nav lielāks par 3000 bāzes pāriem (3 kbp [10]). Izmantojot dažādu polimerāžu maisījumu, izmantojot piedevas un noteiktos apstākļos, PCR fragmenta garums var sasniegt 20-40 tūkstošus bāzes pāru. Tas joprojām ir ievērojami mazāks par eukariotiskās šūnas hromosomu DNS garumu. Piemēram, cilvēka genoms sastāv no aptuveni 3 miljardiem bāzu pāru [11].

Reakcijas komponenti Rediģēt

Vienkāršākajā gadījumā PCR ir nepieciešami šādi komponenti:

  • DNS matricasatur DNS, kas jāpastiprina.
  • Divi primeripapildina vēlamo DNS fragmentu dažādu ķēžu pretējos galus.
  • Termostabils DNS polimerāze - enzīms, kas katalizē DNS polimerizācijas reakciju. Polimerāzei, kas izmantojama PCR, ilgstoši jāpaliek aktīvai augstās temperatūrās, tādēļ tiek izmantoti no termofiliem izolēti fermenti. Thermus aquaticus (Taq-polimēra), Pyrococcus furiosus (Pfu-polimēra), Pyrococcus woesei (Pwo-polimēra), Thermus thermophilus (Tthpolimerāze) un citi.
  • Dezoksiribonukleozīdu trifosfāti (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Mg 2+ joniem, kas nepieciešami polimerāzes darbībai.
  • Buferšķīdumsnodrošinot nepieciešamos reakcijas apstākļus - pH, šķīduma jonu stiprums. Satur sāli, liellopu seruma albumīnu.

Lai izvairītos no reakcijas maisījuma iztvaikošanas, mēģenei pievieno augstu verdošu eļļu, piemēram, vazelīna eļļu. Ja izmanto apkures vāciņu, tas nav nepieciešams.

Pirofosfatāzes pievienošana var palielināt PCR reakcijas iznākumu. Šis enzīms katalizē ortofosfāta pirofosfāta, kas ir nukleotīdu trifosfātu pievienošanas augošajai DNS ķēdei, hidrolīzi. Pirofosfāts var inhibēt PCR reakciju [12].

Primers Edit

PCR specifika balstās uz komplementāru kompleksu veidošanos starp matricu un primeriem, īsiem sintētiskiem oligonukleotīdiem, kuru garums ir 18-30 bāzes. Katrs no primeriem papildina vienu no divkāršās matricas ķēdēm un ierobežo pastiprinātā reģiona sākumu un beigas.

Pēc matricas hibridizēšanas ar gruntēšanu (atkausēšana [13]), tā kalpo par primeru DNS polimerāzei matricas komplementārās ķēdes sintēzes laikā (skatīt tālāk).

Svarīgākais grunts raksturojums ir kušanas temperatūra (Tma) kompleksā grunts matrica.

Tm - temperatūra, kurā puse no DNS veidnes veido kompleksu ar oligonukleotīdu primeri. Vidējā skaitīšanas formula Tm īsu oligonukleotīdu (un gariem DNS fragmentiem), ņemot vērā K + un DMSO jonu koncentrāciju:

kur L ir nukleotīdu skaits primerā, K + ir kālija jonu molārā koncentrācija, G + C ir visu guanīnu un citozīnu summa.

Gadījumā, ja primer vai garināšanas temperatūras garums un nukleotīdu sastāvs ir nepareizi izvēlēts, ir iespējama daļēji komplementāru kompleksu veidošanās ar citiem veidnes DNS reģioniem, kas var novest pie nespecifisku produktu parādīšanās. Kušanas punkta augšējo robežu ierobežo optimālā polimerāzes temperatūra, kuras aktivitāte nokrīt temperatūrā virs 80 ° C.

Izvēloties primerus, vēlams ievērot šādus kritērijus:

40—60 %,

  • aizvērt tm gruntskrāsas (atšķirības ne vairāk kā 5 ° C), t
  • nav specifisku sekundāro struktūru - matadatas [15] un dimeri [16], t
  • Vēlams, lai 3'-galā būtu guanīns vai citozīns, jo tie veido trīs ūdeņraža saites ar matricas molekulu, padarot hibridizāciju stabilāku.
  • Pastiprinātājs Rediģēt

    PCR tiek veikts siltuma ciklētājs - ierīce, kas nodrošina cauruļu periodisku dzesēšanu un sildīšanu, parasti ar precizitāti vismaz 0,1 ° C. Mūsdienu pastiprinātāji ļauj iestatīt sarežģītas programmas, tostarp iespēju "karstās palaišanas", "Touchdown" PCR (skatīt zemāk) un turpmāko pastiprināto molekulu uzglabāšanu 4 ° C temperatūrā. Reālā laika PCR ražo instrumentus, kas aprīkoti ar fluorescējošu detektoru. Ir arī ierīces ar automātisku vāku un mikroplašu nodalījumu, kas ļauj tos iebūvēt automatizētās sistēmās.

    Parasti PCR laikā tiek veikti 20–35 cikli, no kuriem katrs sastāv no trim posmiem (2. attēls).

    Denaturācijas rediģēšana

    Divslāņu DNS veidne tiek uzkarsēta līdz 94–96 ° C (vai līdz pat 98 ° C, ja tiek izmantota īpaši stabila termostabilā polimerāze) 0,5–2 min., Lai DNS ķēdes tiktu atdalītas. Šo posmu sauc par kausēšanu (denaturācija), jo ūdeņraža saites starp divām DNS daļām tiek iznīcinātas. Parasti pirms pirmā cikla ilgstoši iesildās reakcijas maisījums 2-5 minūtes, lai pilnībā denaturētu veidni un gruntus.

    Rūdīšana Rediģēt

    Kad ķēdes ir atdalītas, temperatūra tiek pazemināta tā, ka gruntskrāsas var saistīties ar vienu šķipsnu matricu. Šo posmu sauc atkausēšana. Atdzesēšanas temperatūra ir atkarīga no gruntēšanas sastāva un parasti tiek izvēlēta 5 grādi zem grunts kausēšanas punkta. Nepareiza atkausēšanas temperatūras izvēle izraisa vai nu sliktu primeru piesaisti matricai (paaugstinātā temperatūrā), vai arī saistīšanos nepareizā vietā un nespecifisku produktu izskatu (zemā temperatūrā). Atdzīšanas stadijas laiks ir 30 sekundes, tajā pašā laikā šajā laikā polimerāzei jau ir laiks, lai sintezētu vairākus simtus nukleotīdu. Tāpēc ir ieteicams izvēlēties praimerus, kuru kušanas temperatūra ir virs 60 ° C, un vienlaicīgi veikt 60 ° C līdz 72 ° C temperatūras paaugstināšanu un pagarināšanu.

    Elongācijas rediģēšana

    DNS polimerāze replikē veidnes joslu, izmantojot primer kā sēklu. Tas ir posms pagarinājums. Polimerāze sāk otrās ķēdes sintēzi no primāra 3'-gala, kas ir saistīts ar matricu, un pārvietojas pa matricu, sintezējot jaunu ķēdi virzienā no 5'līdz 3'-galam. Elongācijas temperatūra ir atkarīga no polimerāzes. Bieži lietotās polimerāzes Taq un Pfu visaktīvākais 72 ° C temperatūrā. Paildzināšanas laiks ir atkarīgs gan no DNS polimerāzes veida, gan no amplifikētā fragmenta garuma. Parasti pagarinājuma laiks ir vienāds ar vienu minūti katram tūkstošam bāzes pāriem. Pēc visu ciklu beigām bieži tiek veikts papildu posms. galīgais pagarinājumspabeigt visus viena ķēdes fragmentus. Šis posms ilgst 7-10 minūtes.

    Konkrēta reakcijas produkta daudzums (ko ierobežo primeri) teorētiski palielinās proporcionāli 2 n - 2n, kur n ir reakciju ciklu skaits [17]. Faktiski katra cikla efektivitāte var būt mazāka par 100%, tātad patiesībā P

    (1 + E) n, kur P ir produkta daudzums, E ir cikla vidējā efektivitāte.

    Pieaug arī „garo” DNS kopiju skaits, bet lineāri, tāpēc reakcijas produktos dominē specifisks fragments.

    Nepieciešamā produkta pieaugumu ģeometriskajā progresē ierobežo reaģentu daudzums, inhibitoru klātbūtne, blakusproduktu veidošanās. Pēdējos reakcijas ciklos pieaugums palēninās, to sauc par „plato efektu”.

    • RPA (Angļu rekombināzes polimerāzes amplifikācija - rekombināzes polimerāzes amplifikācija) - tiek izmantota, ja DNS / RNS amplifikācija ir nepieciešama 15 minūtes bez termiskās ciklera (izotermiska reakcija) [18] [19]
    • Nested PCR (Nested PCR (Eng.)) - izmanto, lai samazinātu reakcijas blakusproduktu skaitu. Tiek izmantoti divi primeru pāri, un tiek veiktas divas secīgas reakcijas. Otrais primeru pāris pastiprina DNS reģionu pirmās reakcijas produktā.
    • Apgrieztais PCR (Inverse PCR (Eng.)) - tiek izmantots, ja ir zināma tikai neliela daļa vēlamajā secībā. Šī metode ir īpaši noderīga, ja ir nepieciešams noteikt blakus esošās sekvences pēc DNS ievietošanas genomā. Apvērstā PCR ieviešanai tiek veikta virkne DNS griešanas ar ierobežojumiem, kam seko fragmentu savienošana (ligācija). Rezultātā zināmie fragmenti parādās abos nezināmā reģiona galos, pēc tam PCR var veikt kā parasti.
    • PCR ar reverso transkripciju (Reversie transkripcijas PCR, RT-PCR (angļu valoda)) - lieto, lai pastiprinātu, izolētu vai identificētu zināmu secību no RNS bibliotēkas. Pirms parastās PCR, mRNS veidnē tiek sintezēta viena virkne DNS molekula, izmantojot revertāzi, un tiek iegūta vienšķiedras cDNS, ko izmanto kā veidni PCR. Šī metode bieži nosaka, kur un kad šie gēni ir izteikti.
    • Asimetriska PCR (Angļu asimetriskā PCR) - tiek veikta, ja nepieciešams pastiprināt galvenokārt vienu no sākotnējās DNS ķēdēm. Izmanto dažos secības un hibridizācijas testos. PCR tiek veikta kā parasti, izņemot to, ka viens no primeriem tiek uzņemts lielā pārpalikumā. Šīs metodes izmaiņas ir angļu valoda.Linear-After-TviņšExponenciālais-PCR (LATE-PCR), kas izmanto primārus ar dažādām koncentrācijām, un zemu koncentrāciju primer izvēlas ar augstāku (kušanas punktu) nekā augsta koncentrācija primer. PCR tiek veikta ar augstu atkausēšanas temperatūru, tādējādi ir iespējams saglabāt reakcijas efektivitāti visos ciklos [20].
    • Kvantitatīvais PCR (Kvantitatīvais PCR, Q-PCR (angļu valodā)) vai Reālā laika PCR - izmanto tiešā novērojumā par konkrēta PCR produkta daudzumu katrā reakcijas ciklā. Šī metode izmanto fluorescenti iezīmētus primerus vai DNS zondes, lai precīzi izmērītu reakcijas produkta daudzumu, kad tas uzkrājas, vai tiek izmantota fluorescējoša starpkultūra. Sybr green i (bet labāk izmantot SYTO 13), kas saistās ar divslāņu DNS. Sybr green i nodrošina vienkāršu un ekonomisku iespēju PCR produktu noteikšanai un kvantitatīvai noteikšanai reālā laika PCR laikā, neprasot specifiskas fluorescējošas zondes vai gruntus. Amplifikācijas krāsu laikā SYBR Green I tas tiek ievietots PCR produktu DNS nelielajā gropē un izstaro fluorescējošu signālu, kas ir spēcīgāks par nesaistīto krāsu, kad to apstaro ar zilu lāzeri. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Pirmie cikli tiek veikti temperatūrā, kas ir augstāka par optimālo atkausēšanas temperatūru, tad ik pēc dažiem cikliem temperatūras pakāpeniski samazinās līdz optimālajam temperatūrai. Tas tiek darīts, lai nodrošinātu, ka grunts hibridizējas ar komplementāro ķēdi visā tās garumā, bet optimālā atkausēšanas temperatūrā grunts daļēji hibridizējas ar komplementāro ķēdi. Primera daļēja hibridizācija uz genoma DNS izraisa nespecifisku amplifikāciju, ja primeram ir daudz saistīšanās vietu. Vairumā gadījumu pirmos desmit PCR ciklus var veikt ar atkausēšanas temperatūru 72-75 ° C, un pēc tam nekavējoties samazinot līdz optimālam, piemēram, līdz 60-65 ° C.
    • Molekulārās kolonijas metode (PCR gēls, angļu kolonija - PCR kolonija) - akrilamīda gēla polimerizācija ar visām PCR sastāvdaļām uz virsmas un veic PCR. Punktos, kas satur analizēto DNS, amplifikācija notiek, veidojot molekulāras kolonijas.
    • PCR ar ātru cDNS amplifikāciju (dzimis ātrs cDNS galu pastiprinājums, RACE-PCR).
    • Ilgu fragmentu PCR (eng. Long-range PCR) - PCR modifikācija paplašinātu DNS reģionu amplifikācijai (10 tūkstoši vai vairāk bāzes). Izmantojiet divu polimerāžu maisījumu, no kurām viena - Taq-polimēru ar augstu procesivitāti (kas spēj sintezēt garu DNS ķēdi vienā reizē), un otrais ir DNS polimerāze ar 3'-5'-eksonuklāzes aktivitāti, parasti polimerāze Pfu. Otrā polimerāze ir nepieciešama, lai koriģētu vispirms ieviestās kļūdas Taq-polimērs pārtrauc DNS sintēzi, ja ir pievienots ne-komplementārs nukleotīds. Šis ne-komplementārs nukleotīds noņem Pfu polimerāzi. Polimerāžu maisījumu ņem 50: 1 vai pat mazāk nekā 100: 1 Taq-polimēru lieto 25–100 reizes vairāk nekā Pfupolimēri.
    • Rapd (Polimorfiskās DNS nejaušības pastiprināšana), PCR ar polimorfā DNS nejaušu pastiprināšanu - tiek izmantots, ja ir nepieciešams atšķirt ģenētiskajā secībā līdzīgus organismus, piemēram, dažādas kultivētu augu šķirnes, suņu šķirnes vai cieši saistītus mikroorganismus. Šajā metodē parasti tiek izmantots viens neliels grunts (apmēram 10 bp). Šis primeris daļēji papildinās pētāmo organismu nejaušos DNS reģionus. Izvēloties apstākļus (grunts garumu, tā sastāvu, temperatūru utt.), Ir iespējams panākt apmierinošu atšķirību PCR modelī abiem organismiem.
    • Grupai raksturīga PCR (grupas specifiskā PCR) - PCR saistītām sekvencēm vienā vai starp dažādām sugām, izmantojot konservatīvus primerus šīm sekvencēm. Piemēram, ribosomu gēnu universālo primeru izvēle 18s un 26s sugai raksturīgas starpģenētiskas starplikas: gēnu sekvences amplifikācijai 18s un 26s konservatīvs starp sugām, tāpēc PCR starp šiem gēniem tiks veikta visām pētītajām sugām. Šī metode ir pretēja unikāls PCR (eng. unikāla PCR), kur uzdevums ir atlasīt primerus, lai pastiprinātu tikai vienu visu saistīto secību.
    • PCR, izmantojot karsto palaišanu (Angļu karstā starta PCR) - PCR modifikācija, izmantojot DNS polimerāzi, kurā polimerāzes aktivitāte ir bloķēta istabas temperatūrā ar antivielām vai mazām Affibody tipa molekulām, kas atdarina antivielas, tas ir, brīdī, kad reakcija tiek iestatīta pirms pirmās denaturācijas PCR. Parasti pirmo denaturāciju veic 95 ° C temperatūrā 10 minūtes.
    • Virtuālā PCR (in. in silico PCR, digitālā PCR, elektroniskā PCR, e-PCR) ir matemātiska metode teorētiskās polimerāzes ķēdes reakcijas datoranalīzei, izmantojot primeru secību (vai DNS zondes) sarakstu, lai prognozētu genoma, hromosomas, cirkulārās DNS vai iespējamā DNS pastiprināšanos. jebkuru citu DNS gabalu.

    Ja veidnes nukleotīdu secība vispār vai nav zināma, varat to izmantot degenerētus gruntuskuru secība satur deģenerētas pozīcijas, kurās var atrasties jebkura bāze. Piemēram, primer sekvence var būt: ... ATH ...kur H ir A, T vai C.

    PCR izmanto daudzās jomās analīzei un zinātniskiem eksperimentiem.

    Kriminālistikas rediģēšana

    PCR izmanto, lai salīdzinātu tā sauktos „ģenētiskos pirkstu nospiedumus”. Ir vajadzīgs ģenētiskā materiāla paraugs no noziedzības vietas - asinīm, siekalām, spermu, matiem utt., Kas tiek salīdzināts ar aizdomās turētā ģenētisko materiālu. Ļoti neliels DNS daudzums teorētiski ir viens eksemplārs. DNS atdalās fragmentos, pēc tam pastiprina ar PCR. Fragmentus atdala ar DNS elektroforēzi. Tiek izsaukts DNS joslu izkārtojuma modelis ģenētisko pirkstu nospiedumu (ģenētiskais pirkstu nospiedums).

    Medicīnas diagnostikas rediģēšana

    PCR ļauj ievērojami paātrināt un atvieglot iedzimtu un vīrusu slimību diagnostiku. Vēlamais gēns tiek pastiprināts ar PCR, izmantojot atbilstošus primerus, un pēc tam secīgi, lai noteiktu mutācijas. Vīrusu infekcijas var konstatēt tūlīt pēc infekcijas, nedēļas vai mēnešus pirms slimības simptomu parādīšanās.

    Personalizētā medicīna Rediģēt

    Dažreiz dažiem pacientiem zāles ir toksiskas vai alerģiskas. To iemesli daļēji ir atsevišķas atšķirības zāļu un to atvasinājumu jutīgumā un metabolismā. Šīs atšķirības nosaka ģenētiskā līmenī. Piemēram, vienā pacientā noteiktā citohroms (aknu proteīns, kas atbild par svešķermeņu metabolismu) var būt aktīvāks citā - mazāk. Lai noteiktu, kāda veida citohroms šis pacients ir, tiek ierosināts veikt PCR analīzi pirms zāļu lietošanas. [ avots nav norādīts 3300 dienas Šādu analīzi sauc par sākotnējo genotipa noteikšanu (angļu prospektīva genotipēšana).

    Gēnu klonēšana Rediģēt

    Gēnu klonēšana (ko nedrīkst sajaukt ar organismu klonēšanu) ir gēnu izolācijas process un gēnu inženierijas manipulāciju rezultātā, iegūstot lielu daudzumu gēna. PCR izmanto, lai pastiprinātu gēnu, kas pēc tam tiek ievietots vektoru - DNS fragments, kas satur svešzemju gēnu tajā pašā vai citā, ērts audzēšanai, organismam. Kā vektori izmanto, piemēram, plazmīdu vai vīrusu DNS. Gēnu iekļaušanu svešā organismā parasti izmanto, lai iegūtu šī gēna produktu - RNS vai, visbiežāk, olbaltumvielu. Tādējādi rūpnieciskos daudzumos daudzas olbaltumvielas iegūst izmantošanai lauksaimniecībā, medicīnā utt.

    DNS sekvencēšana Rediģēt

    Sekvencēšanas metodē, izmantojot dideoksinukleotīdu fluorescenci iezīmētu vai radioaktīvu izotopu, PCR ir neatņemama daļa, jo polimerizācijas laikā DNS virknē ievieto nukleotīdus, kas marķēti ar fluorescējošu vai radioaktīvu marķējumu. Dideoksinukleotīda pievienošana sintezētajai ķēdei noved pie sintēzes pārtraukuma, kas ļauj noteikt konkrētu nukleotīdu stāvokli pēc atdalīšanās gēlā.

    Loading...